同源重组法设计引物原则 同源重组中引物的设计为什么需要设计两端引物？

同源重组中引物的设计为什么需要设计两端引物？

看你准备用什么系统来做敲除了。原则上，不同系统对于同源臂长度要求不同，根据这个来设计引物。做敲除一般启动子等元件无需考虑

把目的基因连接到质粒上构建重组质粒时该如何选择限制性内切酶?引物如何设计？

方法非常多，列举一两个：

1.

不同的粘性末端不能相连。所以，如果要相连，就要去除不同的粘性末端，进行平末端相连。

粘末端变成平末端有两种方法：klenow酶的补平或者s1核酸酶的切平。

为了减少载体自连，可以用碱性磷酸酶处理载体。

最后将载体和目的基因链接，构建重组质粒。

2.

设计引物，自带酶切位点，扩增目的基因，直接改变目的基因的酶切位点，然后再用和载体相同的限制酶酶切目的基因，切出相同的粘性末端。

直接将酶切完成的目的基因和载体连接。